大三巴牌坊的前身聖保祿教堂是由耶穌會於澳門創辦的聖保祿學院的附屬部分。在天主教中，聖保祿被形容為最偉大的傳教士之一，他曾三次出外進行傳教活動，走遍地中海和意大利半島等地，學院以他的名字命名，寓意耶穌會遠赴東方傳教是繼承聖保祿的事業。其中文「三巴」一名則來自聖保祿的葡萄牙文「São Paulo」的漢語譯音。

1835年，一場大火燒毀了聖保祿學院及教堂，至今殘剩教堂的正面前壁、大部分地基以及教堂前的68級石階，由於本地人認為教堂前壁形似中國傳統牌坊，故將之稱為「大三巴牌坊」。

聖保祿教堂也是中國第一座巴洛克式建築，其前壁在建造時將東方的裝飾圖飾如中國傳統造型的石獅子、漢字和象徵日本的菊花與歐洲的古典元素相結合，屬於東西方藝術交融的結晶，代表了天主教藝術在遠東的成就，也反映了澳門在歷史上的東西文化交融及其獨特性。

聖保祿教堂前壁由花崗石建成，高27公尺、闊23.5公尺、石壁厚2.7公尺[2]。至今學界仍然未能得知製作教堂前壁的藝術家和工匠的名字，但目前可知的是他們大部分都是從日本逃難到澳門的日本人天主教教徒建築師和工匠，且當時澳門城內有讓從日本來的工人建築教堂的傳統。

大三巴牌坊可分為上下五層，每層均有多種多樣的雕刻，反映出天主教的信仰精神及其所帶出的宗教信息。另外，牌坊上的七尊銅像相信是由在17至18世紀曾經「聞名退通，遠銷各洲」的澳門博卡羅鑄砲場鑄造。